Oczyszczanie tubuliny z kontrolowanymi modyfikacjami potranslacyjnymi i izotypami z ograniczonych źródeł poprzez cykle polimeryzacji-depolimeryzacji

Oczyszczanie tubuliny z kontrolowanymi modyfikacjami potranslacyjnymi i izotypami z ograniczonych źródeł poprzez cykle polimeryzacji-depolimeryzacji

Jednym z ważnych aspektów badań cytoszkieletu mikrotubul jest badanie zachowania mikrotubul w eksperymentach rekonstytucji in vitro. Umożliwiają one analizę wewnętrznych właściwości mikrotubul, takich jak dynamika, oraz ich interakcji z białkami związanymi z mikrotubulami (MAP). „Kod tubuliny” to nowa koncepcja, która wskazuje na różne izotypy tubuliny i różne modyfikacje potranslacyjne (PTM) jako regulatory właściwości i funkcji mikrotubul. Aby zbadać molekularne mechanizmy kodu tubuliny, kluczowe znaczenie ma przeprowadzenie eksperymentów rekonstytucji in vitro przy użyciu oczyszczonej tubuliny o określonych izotypach i PTM. Do tej pory było to trudne technicznie, ponieważ tubulina mózgowa, która jest szeroko stosowana w eksperymentach in vitro, zawiera wiele PTM i ma określony skład izotypowy.

Dlatego opracowaliśmy ten protokół, aby oczyścić tubulinę z różnych źródeł iz różnymi składami izotypów i kontrolowanymi PTM, stosując klasyczne podejście cykli polimeryzacji i depolimeryzacji. W porównaniu z istniejącymi metodami opartymi na oczyszczaniu na zasadzie powinowactwa, to podejście daje czystą tubulinę zdolną do polimeryzacji, ponieważ tubulina odporna na polimeryzację lub depolimeryzację jest odrzucana podczas kolejnych etapów oczyszczania.

Opisujemy oczyszczanie tubuliny z linii komórkowych hodowanych w zawiesinie lub jako hodowle adherentne oraz z mózgów pojedynczych myszy. W metodzie najpierw opisano wytwarzanie masy komórek zarówno w zawiesinie, jak i przylegających, etap lizy, po którym następują kolejne etapy oczyszczania tubuliny w cyklach polimeryzacji-depolimeryzacji. Nasza metoda pozwala na uzyskanie tubuliny, którą można wykorzystać w eksperymentach dotyczących wpływu kodu tubuliny na wewnętrzne właściwości mikrotubul i interakcji mikrotubul z towarzyszącymi białkami.

Wiremię HIV można kontrolować za pomocą przewlekłej terapii przeciwretrowirusowej. Jako potencjalnie jednorazowa alternatywa, komórki B zmodyfikowane przez CRISPR / Cas9 w celu ekspresji szeroko neutralizujących przeciwciał (bNAb) anty-HIV są zdolne do wydzielania wysokich mian przeciwciał. Tutaj pokazujemy, że po immunizacji myszy adaptacyjnie przeniesiono zmodyfikowane komórki B do ośrodków rozmnażania (GC), gdzie dominują one nad odpowiedzią endogenną i różnicują się w komórki pamięci i plazmatyczne, przechodząc rekombinację zmiany klas (CSR).

Immunizacja antygenem o wysokim powinowactwie zwiększa akumulację w GC i wskaźnik CSR. Wzmocniona immunizacja zwiększa wskaźnik zmodyfikowanych komórek B w GC i wydzielanie przeciwciał, wskazując na zatrzymanie pamięci. Wreszcie, sekwencje przeciwciał zmodyfikowanych komórek B w śledzionie wykazują wzorce selekcji klonalnej. Dlatego komórki B można przekształcić w coś, co może być żywym i ewoluującym lekiem.

Aktualne rozważania na temat charakterystyki izotypu immunoglobuliny w odpowiedzi przeciwciał przeciwko lekom biologicznym

Powszechnie akceptowano zdolność bioterapeutyków do wywoływania odpowiedzi immunologicznej u pacjentów. Oczekuje się, że humoralna odpowiedź immunologiczna na bioterapeutyki będzie miała charakter poliklonalny i będzie charakteryzować się wysokim stopniem różnorodności, w tym skład izotypu immunoglobuliny wywołanej leczeniem przeciwciał przeciwlekowych (ADA). Leki o silnym potencjale indukowania odporności mogą wywoływać odpowiedź zależną od limfocytów T, co skutkuje stopniowym przejściem od początkowej IgM do dojrzałych ADA opartych na IgG.

Zmiana klasy immunoglobulin i przejście na przeciwciała IgG1 i IgG4 o wysokim powinowactwie były powiązane ze zmniejszoną skutecznością leku, przyspieszonym klirensem, rozwojem przeciwciał neutralizujących lek i modulacją szybkości reakcji nadwrażliwości. Przedstawione tu przykłady pokazują, że zrozumienie składu izotypowego odpowiedzi ADA może być bardzo ważne dla przewidywania przyszłości progresji choroby. Charakterystyka izotypowa odpowiedzi ADA może być postrzegana jako wysoce przydatna, szczególnie w przypadku bioterapeutyków o wysokim ryzyku immunogenności, chociaż może być mniej przydatna lub może być stosowana jako narzędzie badawcze tylko w przypadku leków o średnim i niskim poziomie ryzyka immunogenności. W niniejszym dokumencie przedstawiono cechy charakterystyczne dla izotypów, metody wykrywania i kilka studiów przypadku.

Kliniczne zastosowanie przeciwciał monoklonalnych (mAb) zrewolucjonizowało dziedzinę terapii raka, ponieważ umożliwiło skuteczne leczenie wcześniej nieuleczalnych typów raka. W działaniu przeciwnowotworowym mAb odgrywają rolę różne mechanizmy. Obejmują one blokowanie specyficznych dla guza receptorów czynnika wzrostu lub cząsteczek immunomodulujących, a także lizę komórek nowotworowych za pośrednictwem dopełniacza i komórek. Tak więc, dla wielu mAb, funkcje efektorowe, w których pośredniczy Fc, mają krytyczny wpływ na skuteczność leczenia.

Ponieważ izotypy Ig różnią się zdolnością do wiązania się z FcR na komórkach odpornościowych, a także zdolnością do aktywacji dopełniacza, różnią się one aktywowaną przez nie odpowiedzią immunologiczną. Dlatego wybór izotypu przeciwciała dla terapeutycznych mAb jest podyktowany zamierzonym mechanizmem działania. Biorąc pod uwagę, że skuteczność kliniczna wielu mAb jest obecnie osiągana tylko w podgrupach pacjentów, optymalna selekcja izotypów i optymalizacja Fc podczas tworzenia przeciwciał mogą stanowić ważny krok w kierunku poprawy wyników leczenia pacjentów. Tutaj omawiamy aktualną wiedzę o terapeutycznych funkcjach efektorowych różnych izotypów i strategiach inżynierii Fc w celu ulepszenia aplikacji mAb.

Oczyszczanie tubuliny z kontrolowanymi modyfikacjami potranslacyjnymi i izotypami z ograniczonych źródeł poprzez cykle polimeryzacji-depolimeryzacji

Metoda oznaczania nanoporów wspomagana chemią redukcyjną dla izotypów immunoglobulin

Immunoglobuliny mogą wiązać się z nieograniczoną liczbą obcych antygenów prezentowanych układowi odpornościowemu. Wśród tych izotypów IgG i IgM odgrywają kluczową rolę we wstępnej obronie immunologicznej związanej z czynnikami odporności wrodzonej. Dlatego określenie niedoborów IgG i IgM lub różnych stężeń jest szeroko stosowane jako wskaźnik diagnostyczny zaburzeń związanych z niedoborem odporności. W tym dokumencie opisujemy metodę nanoporową wspomaganą chemią redukcji do oznaczania IgG i IgM. TCEP (tris (2-karboksyetylo) fosfina) zastosowano do rozszczepienia białek Ig na fragmenty za pomocą redukcji wiązań dwusiarczkowych w różnych warunkach doświadczalnych. Strategia ta umożliwiła obserwację rozróżnialnych sygnałów prądowych dostarczanych przez oddzielne fragmenty polipeptydów w nanoporze αHL.

Wraz z wynikami symulacji dynamiki molekularnej (MD), wysoce efektywnymi potencjałami elektrostatycznymi i wiązaniami H, dominującymi czynnikami dla tych sygnałów prądowych, ułatwiły wychwytywanie fragmentów Ig w nanoporze α-HL. Co ważniejsze, sygnały sygnaturowe można było zastosować do rozróżniania IgG i IgM w surowicy krwi bez żadnych problemów związanych z adsorpcją białek i zatykaniem nanoporów. Ponadto, biorąc pod uwagę czułość wykrywania i selektywność porównawczą, wyciągnięto wniosek, że nasza metoda jest jednocząsteczkowym podejściem bez znakowania do pomiaru stanów chorobowych, które występują w wyniku braku lub nadmiernej obecności izotypów immunoglobulin.

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *